活体钙成像技术是解析脑功能网络、探索神经生理机制的核心手段，实验结果准确性依赖从分子标记到信号采集各环节的标准化操作。病毒注射需实现靶向神经元精准标记，梯度折射率（GRIN）透镜植入需保障脑深部信号传递，数据采集需兼顾信号质量与行为同步性，任一环节偏差均可能影响结果可靠性。梳理完整规范的活体钙成像实验流程，对推动神经科学研究的可重复性与科学性意义重大。

一、病毒注射

前期准备：手术器械高压灭菌，准备10μL注射器，生理盐水灌注排泡后连微量泵；加热垫维持35℃，保障实验动物体温。

动物麻醉与固定：麻醉小鼠至呼吸频率每秒1次，置于立体定位台，用耳棒、鼻夹固定头部，确保手术中无移动。

消毒与皮肤处理：7.5%聚维酮碘溶液、70%乙醇交替消毒小鼠头部无毛区三次；皮下注射50微升2%利多卡因局部麻醉，沿中线切开皮肤约2厘米，暴露颅骨顶骨缝与前囟。

颅骨处理与病毒装载：剥离颅骨筋膜，调整鼻托使前囟、后囟处于同一Z位置；30号针头去除硬脑膜，清理骨屑时无菌棉签止血并生理盐水保湿；微量泵以每秒50纳升速度抽500纳升气泡后，抽取800纳升稀释后病毒（如表达GCaMP6f的腺相关病毒1型）。

病毒注射操作：针尖轻触前囟记录Z坐标，钻孔上方注100纳升病毒确认针头通畅；缓慢进针至D/V轴Z坐标1.75毫米，上移至1.65毫米形成囊袋，以每分钟50纳升速度注500纳升病毒，10分钟后等待5-10分钟拔针。术后清洗注射器，缝合皮肤并涂抗生素软膏，小鼠归笼。

二、梯度折射率（GRIN）透镜植入

二次麻醉与准备：小鼠恢复后，按体重腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合液（氯胺酮100毫克/千克、赛拉嗪15毫克/千克）麻醉，大腿肌肉注射2毫克/千克地塞米松防肿胀炎症；手术区皮下注50微升2%利多卡因。

颅骨钻孔与组织抽吸：特殊工具精准钻孔，27g针头连真空系统自动逐层抽吸脑组织，形成深度0.8毫米、直径1毫米的柱形凹槽。

透镜植入与固定：将GRIN透镜植入凹槽，确保位置精准以传递脑深部钙图像，周边组织处理保障透镜稳固。

术后护理：皮下注射1毫升预热生理盐水，再注0.1毫克/千克布托啡诺助恢复，密切观察小鼠状态。

三、数据采集

设备连接与调试：微型显微镜固定于小鼠颅骨支架，调试成像系统光源、滤光片，保证激发光功率适中（避免光漂白），调整二向色镜与滤光片，确保波长精准传输。

成像与行为记录同步：开启设备采集神经元钙图像，同步记录小鼠行为，建立神经活动与行为的关联。

数据存储与初步处理：妥善存储钙成像与行为学数据，用软件去除噪声、校正基线，为后续分析做准备。

活体钙成像实验是从分子标记到信号采集的系统工程，病毒注射精准度决定神经元标记特异性，GRIN透镜植入质量影响信号传递效率，数据采集规范性关联结果可信度。各步骤需严守操作标准，兼顾无菌、动物福利与设备精度，通过标准化流程控制降低误差，为解析神经元活动规律、揭示脑功能机制提供可靠支撑。